1、概要
用于生产有价值的化学品的合成生物学方法干预了底盘细胞的天然新陈代谢途径，以平衡所需化学品的合成和生物质的生产。然而，通过进化，天然代谢的结构和调节已经被优化，以适应宿主生物体的特定需要，这经常使得将代谢通量重新引导到合成所需产品的异源途径上特别具有挑战性。克服这一障碍的一个解决方案是减少异源途径与底盘天然新陈代谢的联系。理想情况下，异源途径必须与宿主途径正交。正交性的概念描述了在不影响同一系统的其他组件的性能的情况下改变系统组件的能力。
对于正交的路径，它必须只有一个来自基本代谢的分支点。建立正交路由有利于改善路径控制和性能。可以利用独特的分支点创建代谢阀门，将通量重定向到正交路线，并根据代谢状态或生长阶段进行动态调节。
单萜类化合物被广泛用作香料、抗菌剂和杀虫剂，它们的应用已扩大到包括高密度燃料、可再生聚合物和绿色塑料。然而，从自然来源中提取单萜不能满足日益增长的需求，这促使人们努力在微生物中进行生物技术生产。单萜支架是通过单萜合成酶转化典型的萜烯前体香叶基二磷酸(GPP)来合成的，该酶催化底物的重排产生过多的结构（下图）。
目前为止，GPP衍生化合物的生产效率明显较低。造成这种低效率的因素之一可能是酵母中类异戊二烯生物合成途径的结构，它是生产FPP衍生分子的最佳途径，而FPP衍生分子是酵母生长和生存所必需的。该途径的一个关键特征突出了这种代谢优化，即天然酵母戊烯基转移酶Erg20p合成FPP的顺序性质。Erg20p是一种双功能酶，它催化该途径的两个连续步骤；最初，它将DMAPP和IPP缩合成GPP，然后它催化GPP与另一个IPP分子缩合生成FPP。这有利于细胞的新陈代谢，因为酵母不会自然产生其他GPP衍生化合物。然而，Erg20p催化的顺序反应似乎限制了GPP存储量，阻碍了单萜类化合物的生产。过表达GPP合酶以增加GPP利用率仅导致适度的单萜增加，因为增加的GPP通量被内源Erg20p有效地引导以产生固醇和其他必要的异戊二烯。在进一步的努力中，Erg20p被设计成只在FPP合成步骤中效率低下，在没有取消固醇合成的情况下增加了GPP存储量。然而，尽管通过对天然Erg20p的N端去依存性蛋白降解来减少与引入的单萜合成酶的竞争，获得的单萜效价比其他工程酵母平台生产的倍半萜的效价低了几个数量级。这些观察结果表明，酵母中单萜的生物合成仍有相当大的潜力。
2、研究过程
在这里，研究者使用NPP作为替代底物来建立一条生产单萜支架的正交途径。研究者们在单萜烯合成酶中确定了一个决定异构体底物选择性的单一残基，并设计了规范的萜烯合成酶来特异性地接受替代底物。
首先证实了在之前的努力中观察到的单萜的效价不是由于产品*性，而其他因素如途径结构，可能起到重要作用。研究者评估了酵母细胞的生长情况，这些酵母细胞被设计来提供高水平的类异戊二烯前体。为了评价单萜产量是否受到产物存在的限制，研究者们评价了ClLimS在添加不同浓度柠檬烯的AM94细胞培养物中产生柠檬烯的情况。在所有情况下，覆盖层中柠檬烯的浓度增加了相似的量，这表明酵母细胞的柠檬烯产量在所有条件下都是相似的，没有观察到抑制作用。之后证实Erg20p的顺序反应可能是导致单萜产量低的一个因素，研究者们在表达ClLimS的AM94细胞的细胞提取物中添加了类异戊二烯前体，并测量了柠檬烯的形成。在IPP和DMAPP存在下加入GPP，导致柠檬烯的产量较低，而FPP的产量显著增加。表明确实是Erg20的顺序反应造成这种现象。
将编码SlNPPS1的cDNA片段克隆到PTDH3组成型启动子下的酵母载体pHTDHmyc，并在AM94菌株中表达。（引入了三种对NPP特异性合酶）下图质谱表明了在SlNPPS1的存在下，三种酶都得到了对应的产物。
为单萜生物合成建立的新分支点可以起到阀门的作用，引导底物的流量远离FPP合成，并增加单萜烯的产量。首先，目标是减少Erg20p对IPP的竞争。为实现这一目标，引入了Erg20p(NW)，一个显负性Erg20p突变体，它抑制了内源野生型酶的FPP合成步骤。之前的研究表明，将一种异源酶融合到Erg20p中可以有益于该酶稳定性。
研究者将SlNPPS1至Erg20p(NW)的C末端连接，证实融合蛋白达到了比未融合的SlNPPS1更高的细胞内水平。随后将Erg20p(NW)-SlNPPS1变体引入菌株MIC2，以实现额外1.4-2倍的产量提高。
为了充分开发正交途径的潜力，研究者们开始对所选的典型单萜合成酶进行工程改造，目的是提高它们对NPP的效率和特异性。最初，研究者们专注于SfCinS1，因为结构信息的可用性和研究者们以前设计这种酶以改变其底物和产品特异性。研究者们开发了一个包含19个变异体的文库，该文库位于活性位点的不同位置。在这里，研究者们在产生GPP和NPP的酵母菌株中对这个文库进行了差异筛选，以确定可能影响底物特异性的位点。如图所示，F位点在两种异构底物之间的选择中起着关键作用，因为该位置的几个变体能够显著提高NPP的酶性能。
动态控制在DMAPP和IPP缩合点创建的代谢阀，以响应内部代谢物水平将通量转向NPP。研究者们发现系统中的一个关键代谢物是麦角固醇，它是主要的酵母固醇。为了在合成足够水平的麦角固醇时减少流向固醇分支的流量，研究者们实施了基于ERG1基因启动子的动态设计。ERG1的表达受麦角固醇通过其启动子(PERG1)中的麦角固醇反应调节元件的负调控。为了动态调节FPP的合成以响应研究者们系统中的麦角固醇水平，研究者们用含有麦角固醇反应元件的PERG1的bp区域取代了菌株MIC2中ERG20的启动子，从而产生了菌株MIC3。使用工程的NPP特异性合成酶和菌株MIC3，这能够以比天然的基于GPP的途径相当高的效率生产单萜。
3、结论与展望
作者建立了一条基于另一种萜烯合成酶底物和优先利用异构体底物的工程萜烯合成酶合成单萜类化合物的合成路线。这种正交途径比天然的基于GPP的途径更有效。通过对13C标记底物的动力学研究和竞争实验，我们证实了NPP途径性能提高的基础是NPP与GPP不同，NPP不被Erg20p消耗来产生固醇。正交途径的构建在DMAPP和IPP缩合点建立了一个代谢阀，使其能够动态控制。
在未来的工作中，可以通过引入更复杂的控制机制来实现额外的效价改善，例如Erg20p的工程降解或代谢建模，以确定动态调节的额外目标。该方法对异构体可以提供正交性的其他高价值化合物的工程具有更广泛的意义，为在生物生产系统工程中应用合成路线设计和正交性考虑提供了蓝图。
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇